罗吉¹ ，罗燕¹ ，李勇敏¹ ，谭小宁¹ ，吕元¹ ，马荣丽²，蒋益兰^1*

（1湖南省中医药研究院 湖南省中医药研究院附属医院 湖南长沙 410006  

   2湖南中医药大学 湖南中医药大学研究生院 湖南长沙   410208）

[摘要]  目的：观察健脾消癌方对结肠癌SW620细胞中转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β)/长链非编码RNA -ATB（Long noncoding RNA ATB，lncRNA-ATB）/微小RNA 200a（microRNA 200a，miR-200a）信号通路的影响，探讨健脾消癌方抑制结直肠癌转移的可能作用机制。方法：10%、15%、20%健脾消癌方含药血清处理TGF-β诱导后SW620细胞，实时定量荧光聚合酶链式反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测lncRNA-ATB、miR-200a、ZEB1 mRNA的表达水平，蛋白质免疫印迹法（Western blot，WB）检测E盒结合锌指蛋白（Zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1）蛋白的表达水平。结果：lncRNA-ATB、miR-200a、ZEB1 mRNA的表达水平比较：与空白组比较，TGF-β诱导组的lncRNA-ATB相对表达量明显升高、miR-200a相对表达量下降、ZEB1 mRNA相对表达量升高，差异有显著统计学意义（P ＜0.01）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方低剂量组lncRNA-ATB相对表达量降低、miR-200a相对表达量升高、ZEB1 mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方中、高剂量组lncRNA-ATB相对表达量显著降低、miR-200a相对表达量升高、ZEB1 mRNA相对表达量降低，差异有显著统计学意义（P ＜0.01）。ZEB1 蛋白表达水平的比较：与空白组比较，TGF-β诱导组的ZEB1 蛋白相对表达量升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方低剂量组ZEB1 蛋白相对表达量稍降低，差异无统计学意义（P＞0.05）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方中、高剂量组ZEB1 mRNA相对表达量降低，差异有显著统计学意义（P ＜0.01）。结论：健脾消癌方可能通过抑制SW620细胞TGF-β诱导的lncRNA-ATB的表达，增加miR-200a的表达，降低ZEB1的表达来抑制结肠癌的转移。

关键词：健脾消癌方；SW620细胞；转化生长因子-β；长链非编码RNA -ATB；微小RNA 200a

 The effect of Jianpi Xiaoai Decoction on TGF-β/LncRNA-ATB/miR-200a signal pathway in colorectal cancer

LUO Ji¹, LUO Yan¹, LI Yong-min¹，TAN Xiao-ning¹, MA Rong-li², JIANG Yi-lan ^1*

（1. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine, Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410006, China ；2 Graduate of Hunan University of Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine,  Changsha, Hunan 410208, China.）

[Abstract]  Objective: Observe the effect of Jianpi Xiaoai Decoction (JPXAD) on the transforming growth factor-β(transforming beta growth factor-β, TGF-β) / LncRNA -ATB (Long noncoding RNA-ATB) /miR-200a(microRNA 200a) signal pathway in colon cancer cells SW620 and eluminate the anti-metastatic effect of JPXAD in colorectal cancer. Methods:10%, 15%, 20% JPXAD -containing serum was given to SW620 cells after the treatment of TGF-β, qRT-PCR was applied to detect the expression levels of lncRNA-ATB, miR-200a and ZEB1 mRNA, and Western blot was used to determine the expression level of ZEB1 protein. Results:Compared with the control group, the relative expression of lncRNA-ATB in TGF-βgroup increased, the relative expression of miR-200a decreased and ZEB1 mRNA relative expression increased significantly (P < 0.01); compared with TGF-βgroup, the expression level of lncRNA-ATB in JPXAD low-dose group decreased , miR-200a increased and ZEB1 decreased significantly (P < 0.05); compared with TGF- β group, the expression level of lncRNA-ATB in JPXAD median- and high - dose group decreased , miR-200a increased and ZEB1 decreased significantly (P < 0.01). Compared with the control group, the relative expression of ZEB1 protein in TGF-βgroup increased significantly (P < 0.05); compared with TGF-βgroup, the ZEB1 protein expression level in JPXAD low-dose group decreased slightly (not statistically significantly, P > 0.05); compared with TGF-βgroup, the ZEB1 protein expression level in JPXAD median- and high - dose group decreased significantly (P < 0.01). Conclusion:JPXAD may inhibit the metastasis of colorectal cancer by inhibiting the expression of lncRNA-ATB induced by TGF- β increased the level of miR-200 and decreased the expression of ZEB1 protein.

Key words：Jianpi Xiaoai Decoction；SW620 cells; Transforming beta growth factor-β; Long noncoding RNA-ATB; microRNA 200a

结直肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，随着我国人口老龄化、生活方式、饮食习惯的改变，发病率和死亡率均处于高水平，2013年我国新增结直肠癌患者约34.8万例，发病率居恶性肿瘤的第四位；死亡患者约16.5万例，死亡率居恶性肿瘤的第五位^[1]。目前，手术切除是治疗结直肠癌的首要手段，但是约20%的结直肠癌患者发现时已处于Ⅳ期，这些患者中80%出现了不能手术切除的转移性病变，虽可采取放化疗、靶向治疗等，但其带来的毒副作用、耐药性等，在一定程度上制约了西医对中晚期结直肠癌的治疗^[2-3]。中医药治疗结直肠癌尤其独特优势，其参与到结直肠癌的治疗过程中，并通过抑制结直肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期，抑制侵袭与迁移，影响血管生成，逆转耐药等起到抗术后复发和转移，减毒增效，改善症状和生活质量，延长生存期等作用^[4-5]。本课题组长期致力于中医药防治结直肠癌的研究，并通过多年临床经验总结出治疗结直肠癌的有效方剂--健脾消癌方，我们前期已证实其可通过调节MMP-9、TIMP-1、VEGF、ES等因子影响血管生成，并可通过逆转TGF-β诱导的EMT过程治疗结直肠癌^[6-7]。但是，TGF-β调控EMT的机制复杂，据报道，TGF-β诱导的lncRNA-ATB可通过调控miR-200/ZEB1在抑制肝癌、骨肉瘤、结直肠癌等增殖、迁移、侵袭中起到关键作用^[8-9]。但是中医药能否通过调控TGF-β/LncRNA-ATB/miR-200a在结直肠癌中起作用尚未见报道，本实验拟从该信号通路进一步研究健脾消癌方治疗结直肠癌的作用机制。

1.材料

1.1细胞株和动物

   人结肠癌细胞株HCT116细胞购自中国科学院上海细胞中心；SD大鼠20只，雌雄各半，购自湖南省长沙斯莱克实验动物中心，生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，使用许可证号：SYXK（湘）2015-008，批号：43004700015702。

1.2药物

健脾消癌方药材（药物组成：人参10 g，薏苡仁30 g，半枝莲30 g，重楼10 g，莪术10 g，郁金15 g）购自湖南省中医药研究院附属医院中药房，经湖南省中医药研究院附属医院药剂科主任田其学主任药师鉴定，所有药材符合药典标准。2倍量处方，温水浸泡1 h，水量超出药物5-6 cm，大火煮沸后转小火煎30 min，趁热过滤，药渣按前法再煎煮两次，将3次药液混匀、过滤，减压浓缩为相当于生药1.5 g·mL^-1，4℃保存，1周内用完。

1.3试剂

Dulbecco’s modified Eagle Media（DMEM）培养基（美国Life technology公司，批号：05197），胎牛血清（美国Life technology公司，批号：1640958）， cDNA逆转录试剂盒（日本Takara公司，批号：RR047Q）、RT-PCR试剂盒（日本Takara公司，批号：RR430A），ZEB1抗体（美国CST公司，批号：3396）、β-actin蛋白抗体（美国sigma公司，批号：A5316），二抗抗体购自中杉金桥公司（批号：T14987）。

1.4 仪器

HERAcell2401型二氧化碳细胞培养箱（美国Thermo公司），480II型荧光定量PCR仪（瑞士ROCHE公司），FACSCalibur型流式细胞分析仪（美国BD公司），SE300型蛋白质电泳仪（美国Hoefer公司），TE22型蛋白质转膜仪（美国Hoefer公司），GBOX型凝胶成像系统（美国Syngene公司）。

2.方法

2.1细胞培养

HCT116细胞培养于含10%胎牛血清、100 U·ml^-1青霉素和链霉素的DMEM（高糖）培养液中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱内进行培养，细胞汇合率达 80% 左右，胰酶消化细胞成单个细胞悬液，1：3进行传代培养。

2.2健脾消癌方含药血清制备

将SD大鼠随机分成对照组和药物组，每组10只。按照人与大鼠体表面积计算比值换算公式计算大鼠用药剂量^[10]，实验组按相当于70 kg成年人105 g/天的药物量，即9.45 g/kg药物量对大鼠进行灌胃；对照组按大鼠体重灌胃等容积的生理盐水。每天灌胃1次，连续6天，于第7天最后1次灌胃后1 h，10%水合氯醛按0.3 ml/100g剂量腹腔麻醉大鼠，腹主动脉取血，4 ℃保存，24 h内离心（2000 r·min^-1，10 min），吸取血清，合并同组动物血清，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存备用^[11]。

2.3分组给药

选择对数生长期的SW620细胞按5×10⁵/孔接种于60 mm的培养皿中，每组设置3个重复，每皿6 ml培养基；置于37 ℃，5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱内进行培养过夜，次日，更换新鲜培养基。将细胞分为空白组（15 %空白血清）、TGF-β诱导组（15 %空白血清）、健脾消癌方低剂量组（10 %含药血清）、健脾消癌方中剂量组（15 %含药血清）、健脾消癌方高剂量组（20 %含药血清），置于37 ℃、5 % CO₂饱和湿度的细胞培养箱内进行培养48 h。

2.2 qRT-PCR检测lncRNA-ATB、miR-200a、ZEB1 mRNA的表达

各组细胞分别培养48 h后，酚-氯仿法提取各组细胞总RNA，琼脂糖凝胶电泳以及紫外分光光度仪测定RNA的完整性，各组样品的吸光度比值均在1.8~2.1之间，符合下一步逆转录实验要求。按PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）试剂盒说明书进行总RNA逆转录实验，逆转录条件： 37℃，30min；98℃，5min；-20℃保存。再以cDNA以模板，与基因特异性引物，通过PCR 扩增lncRNA-ATB、miR-200a、ZEB1 mRNA，扩增条件为：① 94 ℃，30 sec，1个循环；② 94℃，5 sec；59 ℃，30 sec；40个循环；③ 95℃，2 sec；60℃，15 sec；95 ℃，2 sec；1个循环；④ 50℃，保存。RT-PCR反应结束后首先对解离曲线进行分析，确保只有单一产物被扩增；之后对被扩增基因进行相对定量分析，实验重复3 次。lncRNA-ATB和ZEB1的mRNA表达水平的计算方法：以GAPDG作为内参照，以ΔCt=ΔCt_目的基因-ΔCt_内参基因；ΔΔCt=ΔCt_最低样本-ΔCt_其他样本，计算相对表达RQ=2^-ΔΔCt。 miR-200a的表达水平的计算方法与lncRNA-ATB的mRNA表达水平的计算方法相同，但以U6作为内参照。lncRNA-ATB、miR-200a、ZEB1 mRNA所用引物均由上海生物工程有限公司合成。引物序列见表1：

表1 RT-PCR引物列表

Table 1 The list of primers used in RT-PCR

2.4 Western blot检测ZEB1蛋白的表达

药物处理完毕后，使用蛋白裂解液（强）提总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法测定所提取的蛋白质浓度。按40 μg/孔蛋白进行10%SDS-PAGE分离，湿转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，5%BSA室温封闭2 h，分别加入适量稀释后抗体ZEB1（1∶1000），β-actin（内参，1∶5000），在摇床上4℃孵育过夜；吐温与三乙醇胺缓冲盐水溶液（TBST）洗涤（每次洗涤15 min，共3次），分别加入相应二抗，山羊抗兔（1∶5000，应用于ZEB1）、山羊抗小鼠（1∶5000，应用于β-actin），室温摇床合适摇速孵育1 h，TBST洗涤（每次洗涤15 min，共2次），TBS洗涤一次15 min，加入适量增强化学发光法（plus-ECL）发光试剂，暗室内曝显影，图像分析。    

2.4 统计学分析

采用GraphPad prism 6软件进行统计分析，计量数据采用均数±标准差（`x ± s）表示，数据进行正态分布检验及组间方差齐性检验，符合正态分布及方差齐性，采用单因素方差分析；不符合正态分布、方差分析，采用Kruska-Wallis H进行统计处理；组间两两比较采用LSD法。检验水准为0.05，以P ＜0.05为差异具有统计学意义。

3.结果

3.1 健脾消癌方对结肠癌细胞SW620中lncRNA-ATB相对表达量的影响

与空白组比较，TGF-β诱导组的lncRNA-ATB相对表达量明显升高，差异有显著统计学意义（P ＜0.01）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方低剂量组lncRNA-ATB相对表达量降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方中、高剂量组lncRNA-ATB相对表达量显著降低，差异有显著统计学意义（P ＜0.01）。见表2：

表2 TGF-β（处理48 hr）以及不同浓度健脾消癌方对结肠癌细胞SW620中lncRNA-ATB表达的影响 （`x ± s，n=3）

Table2 The effect of TGF-βand Jianpi Xiaoai decoction treatment on the expression level of lncRNA-ATB in SW620 cells（`x ± s，n=3）

    注：与空白组比较，^1）P＜0.05, ^2）P＜0.01；与TGF-β诱导组比较，^3）P＜0.05, ^4）P＜0.01（表3~5同）。

3.2健脾消癌方对结肠癌细胞SW620中miR-200a相对表达量的影响

与空白组比较，TGF-β诱导组的miR-200a相对表达量下降，差异有显著统计学意义（P ＜0.01）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方低剂量组miR-200a相对表达量升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方中、高剂量组miR-200a相对表达量升高，差异有显著统计学意义（P ＜0.01）。见表3：

表3 TGF-β（处理48 hr）以及不同浓度健脾消癌方对结肠癌细胞SW620中miR-200a表达的影响 （`x ± s，n=3）

Table 3 The effect of TGF-βand Jianpi Xiaoai decoction treatment on the expression level of miR-200a in SW620 cells（`x ± s，n=3）

3.3 健脾消癌方对结肠癌细胞SW620中ZEB1 mRNA相对表达量的影响

与空白组比较，TGF-β诱导组的ZEB1 mRNA相对表达量升高，差异有显著统计学意义（P ＜0.01）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方低剂量组ZEB1 mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方中、高剂量组ZEB1 mRNA相对表达量降低，差异有显著统计学意义（P ＜0.01）。见表4：

表4 TGF-β（处理48 hr）以及不同浓度健脾消癌方对结肠癌细胞SW620中ZEB1 mRNA表达的影响 （`x ± s，n=3）

Table 4 The effect of TGF-βand Jianpi Xiaoai decoction treatment on the expression level of ZEB1 mRNA in SW620 cells（`x ± s，n=3）

3.4健脾消癌方对结肠癌细胞SW620中ZEB1 蛋白表达量的影响

与空白组比较，TGF-β诱导组的ZEB1 蛋白相对表达量升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方低剂量组ZEB1 蛋白相对表达量稍降低，差异无统计学意义（P ＞0.05）；与TGF-β诱导组比较，健脾消癌方中、高剂量组ZEB1 mRNA相对表达量降低，差异有显著统计学意义（P ＜0.01）。见表5：

表5TGF-β（处理48 hr）以及不同浓度健脾消癌方对结肠癌细胞SW620中ZEB1 蛋白表达的影响 （`x ± s，n=3）

Table 5 The effect of TGF-βand Jianpi Xiaoai decoction treatment on the expression level of ZEB1 in SW620 cells（`x ± s，n=3）

4.讨论

上皮间质转化转录因子ZEB1表达的调控机制多种多样，微小RNA（microRNA，miRNA）对其表达的调控便是其中一种。MicroRNAs（miRNAs）是一类在进化上保守，长度为18-25个核苷酸的非编码RNA，其可通过调控下游靶基因蛋白或mRNA水平，在肿瘤细胞的增殖，分化，凋亡和癌变等众多生物学功能起关键作用^[12]。MiR-200a是一类具有双向作用的小分子RNA，它既可作为抑癌基因抑制上皮简直转化转录因子ZEB1、ZEB2的表达，又可通过上皮间质转化促进肿瘤形成^[13]。长链非编码RNA是一类转录本长度一般超过200nt，没有开放阅读框（Open Reading frame，ORF），缺少蛋白编码功能的一类特殊RNA分子，越来越多的研究结果表明lncRNA在肿瘤的发生发展中具有重要的生物学功能^[14-15]。长链非编码RNA -ATB（Long noncoding RNA ATB，lncRNA-ATB）是由TGF-β诱导产生的一类RNA，其在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，其主要通过影响miR-200a的表达，增加EMT转录因子ZEB1在肿瘤组织中的表达影响肿瘤的侵袭迁移^[16]。 .

中医学多认为，结直肠癌多由于“虚”、“瘀”、“毒”相互作用，相互影响而形成。健脾消癌方以人参、薏苡仁益气健脾，以健生化之源，而疗诸虚不足，从而达到扶正固本的目的；莪术、郁金活血化瘀，半枝莲、重楼清热解毒、消痈散结，全方配伍精要，攻补兼施，共奏益气健脾，化瘀解毒之功。研究表明，人参皂苷及其代谢产物、人参多糖和人参炔醇均具有抗肿瘤的功效，其抗肿瘤的机制主要为抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞周期阻滞、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、增强对肿瘤细胞免疫^[17]。薏苡仁中性油脂可调控肿瘤细胞周期蛋白和信号转导蛋白，薏苡仁脂可抗血管生成，薏苡仁多糖可调节机体免疫力，薏苡仁甲醇提取物可诱导肿瘤细胞凋亡^[18]。莪术中的莪术醇、姜黄素、β-榄香烯等可通过阻断肿瘤细胞的生长、增殖、诱导凋亡起到抗肿瘤作用^[19-20]。 温郁金中的蓬莪术二烯、β-榄香烯、δ-榄香烯均可抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡^[21]。半枝莲总黄酮中含有7种抗肿瘤成分，可一定程度上抑制肿瘤细胞的增殖，抑制血管生成，诱导细胞凋亡，而半枝莲多糖可增强机体免疫力^[22-23]。重楼的抗肿瘤作用主要集中于抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化凋亡、调节机体免疫力等^[24]。通过现代药理学研究表明，针对肿瘤发展多因素、多阶段的过程，健脾消癌方也是通过多环节、多靶点起到抗肿瘤的作用。

本实验研究发现SW620细胞经TGF-β诱导后，lncRNA-ATB相对表达量明显升高、miR-200a相对表达量下降、ZEB1 mRNA相对表达量升高；而健脾消癌方含药血清处理48h后，SW620细胞中TGF-β诱导的lncRNA-ATB的表达被抑制，miR-200a表达增加，ZEB1的表达降低，且以上因子的变化水平均与健脾消癌方的用药剂量呈正相关，这提示健脾消癌方可通过调节TGF-β/LncRNA-ATB/miR-200a信号通路来达到治疗结直肠癌的目的。

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